舞台は1938年。冒険家として、また考古学教授として多忙な日々を過ごすインディ・ジョーンズに、大富豪ドノヴァンから相談が持ちかけられる。イエス・キリストの聖杯の所在を示す重大な遺物を手に入れたが、調査隊の隊長が行方不明になり、それを探して欲しいというのだ。 最初は渋っていたインディだったが、その行方不明になった隊長というのが自分の父、ヘンリー・ジョーンズであると聞き、仕方なく依頼を承諾。父が最後に消息を絶ったヴェネツィアに向かった。